Regulación procariota

SISTEMA SOS

¿QUÉ ES?

Es una respuesta global contra el daño del ADN que constituye un mecanismo para tratar las lesiones masivas de ADN y está regulada por los productos de genes lexA y recA que actúan como represor e inductor del sistema respectivamente y que regulan directamente 40 genes.

LexA

La proteína LexA está constituida por 202 aminoácidos y de un peso molecular de 22,7 kDa ampliamente descrita y caracterizada que cumple la función de represor transcripcional de los genes del sistema SOS, incluyendo a recA y el propio lexA. La proteína LexA actúa uniéndose a una región específica localizada en la región promotora de estos genes SOS, denominada caja SOS o LexA, y que se compone de 16 nucleótidos de estructura palindrómica con la secuencia consenso 5’- CTGT(AT)4ACAG-3’. Al unirse inhibe el inicio de la transcripción impidiendo la interacción de la RNA polimerasa con el promotor y el grado de represión es variable dependiendo de la localización exacta de las regiones operadoras con respecto al inicio de transcripción (ATG), los posibles cambios de bases frente a la caja consenso y el número de cajas presentes y la fuerza de la interacción.

La estructura activa y funcional de la proteína LexA es la de un dímero, indispensable para la unión de la proteína al DNA. El proceso de dimerización se lleva a cabo en dos pasos. En primer lugar, se produce la unión de un monómero del represor, a nivel de su dominio N-terminal, al motivo CTGT de la región operadora. A continuación tiene lugar la unión de otro monómero al operador debido a una interacción previa entre las dos moléculas proteicas.

El dominio N-terminal incluye los residuos del 1 al 72, es el motivo de unión al DNA y tiene una estructura similar al motivo canónico HTH (helix-turn-helix), presente en muchas proteínas reguladoras. El sitio de reconocimiento del DNA se encuentra entre las hélices 2 y 3, y precisamente en esta última se produce la interacción con la secuencia operadora de los genes SOS.

Estudios realizados comparando los datos obtenidos por métodos biofísicos y bioquímicos y programas informáticos, han permitido desarrollar un modelo de la interacción del represor LexA con el dominio de unión al DNA. En dicho modelo se establece que la región del represor se sitúa en el surco mayor del DNA y se forman interacciones mediante puentes de hidrógeno entre los residuos Glu45, Glu44 y Asn41 y el motivo CTGT. Adicionalmente se observan interacciones hidrofóbicas entre el DNA y los residuos Ser39, Asn41 y Ala42. Existen otros aminoácidos también implicados en contactos inespecíficos (Arg7, Glu8, Arg38, Ser60 y Arg64) aunque no intervienen directamente en la interacción entre el DNA.

La región conectora abarca desde el aminoácido 73 al 94 y contiene los residuos Ala84 y Gly85, donde se produce la hidrólisis de la proteína LexA. Esta región posee un cierto plegamiento y su interacción con el dominio carboxi-terminal sirve para crear una estructura espacial necesaria para la rotura.

El dominio carboxi-terminal está comprendido entre los residuos 95 al 202 y está implicado en los procesos de hidrólisis, dimerización e interacción con la proteína RecA. En esta región se encuentran los aminoácidos Ser119 y Lys156 que son fundamentales en la hidrólisis de la molécula.

El mecanismo de inactivación del represor LexA consiste en una reacción en la que tanto el substrato de la reacción (sitio de rotura) como el centro catalítico se encuentran en la propia molécula de LexA, y en la que la proteína RecA cataliza la reacción. Por otro lado, esta reacción también puede darse de forma espontánea en condiciones de pH básico.  Concretamente, el sitio de rotura se encuentra entre los aminoácidos Ala84 y Gly85, mientras que el centro catalítico está formado por los aminoácidos Ser119 y Lys156.

Proteína reguladora SOS LexA

LexA actúa como un homodímero para reprimir un número de genes implicados en la respuesta al daño del ADN (respuesta SOS), incluyéndose a sí mismo y RecA.

RecA, en presencia de ADN monocatenario, actúa como co-proteasa para activar una actividad de proteasa autolítica latente (EC 3.4.21.88) de LexA, donde el sitio activo Ser es parte de LexA. El sitio de escisión autolıtica es un enlace Ala-Gly en LexA (en la posición 84-85 en E. coli LexA, esta secuencia se sustituye por Gly-Gly en Synechocystis). La escisión conduce a la desrepresión del regulón SOS y eventualmente a la reparación del ADN. LexA en Bacillus subtilis se llama DinR. LexA está mucho menos distribuida que RecA.

Una visión general de la respuesta SOS en E. coli.

(1) Aumenta la concentración de monómeros LexA. (2) Los monómeros LexA en solución forman dímeros biológicamente relevantes. Los dominios de unión a ADN del LexA no unidos son altamente móviles y pueden moverse libremente entre sí. (3) La represión del sistema SOS se produce cuando los dímeros LexA se unen específicamente a las cajas SOS situadas en las regiones promotoras de los genes SOS y excluyen de forma estérica su transcripción. (4) La holoenzima polimerasa III (Pol) lleva a cabo la replicación del ADN. En el sitio del daño del ADN arrestos de PolIII, y el ADN de una sola cadena (ssDNA) se acumula. RecA se une a ssDNA en presencia de ATP, sr forma RecA-ssDNA-ATP en filamentos activos (RecA *). (5) RecA * induce la auto-división en el LexA no unido pero no puede estimular la inactivación de LexA específicamente unida al ADN diana. (6) En el dímero represor no unido, un monómero está preferentemente inactivado y el monómero no anclado podría afectar al reajuste del sistema. Los productos LexA cortados se degradan rápidamente por las proteasas ClpXP y Lon . (7) Debido a la autoindivisión de LexA inducida inducida, el pool de LexA intracelular disminuye. El represor específicamente ligado de LexA se disocia de los operadores, (8) conduciendo a la desrepresión coordinada de los genes SOS. (9) La tasa de disociación LexA de los sitios objetivo es influenciada por las secuencias del operador y actúa en la orquestación de la respuesta. Posteriormente, cuando se repara el daño en el ADN, la inducción SOS se invierte. Los números en rojo indican novedades en el sistema.

RecA

La proteína RecA, constituida por  352 aminoácidos y 38kDa que es multifuncional y altamente conservada en bacterias, por lo que se han realizado estudios filogenéticos mediante la comparación de su secuencia por el método SSPA.

La unidad funcional de la proteína RecA es en forma de polímero helicoidal regular formado por seis monómeros de RecA por vuelta. Esta estructura es la que rodea la cadena sencilla de DNA, aunque en algunos casos puede estar rodeando a DNA de doble cadena, formando el complejo de filamento nucleoproteico activado. Este filamento tiene como característica relevante la presencia de un surco helicoidal largo. Uno de los lados de este surco es liso, mientras que el otro es irregular debido a las prominencias de los monómeros individuales. Es precisamente en este lugar donde se encuentra el sitio de unión del filamento al represor LexA y también al DNA de doble cadena.

A continuación se describen los diferentes dominios funcionales relacionados con las actividades que desempeñan:

a)   Dominios de unión a nucleótidos e hidrólisis. Son dos dominios altamente conservados que se encuentran en la región de unión A comprendida entre los residuos 66 y 73 (GPESSGKT) y la región B comprendida en los residuos 140- 144, que se encargan, respectivamente, de la unión a ribonucleósido trifosfatos (NTPs) y de la hidrólisis del ATP.

b)   Dominios de unión a DNA. Se ha propuesto que los posibles sitios de unión del DNA a la proteína son los denominados “bucle 1” (156 a 165) y “bucle 2” (194 a 210), que se encuentran en la zona central de la proteína y forman plegamientos. Además podrían haber otros residuos importantes fuera de esta región, como son los residuos 61 a 72, 178 a 183 y 233 a 243 que cumplirían también funciones de unión al DNA.

c)   Dominios de interacción monómero-monómero y entre filamentos. Como se ha descrito la proteína RecA forma oligómeros, resultantes de interacciones hidrofóbicas entre los diferentes monómeros a lo largo de toda la proteína. Los residuos implicados en la interacción entre filamentos se encuentran en zonas alejadas de cada monómero, en sus regiones N- y C- terminal y son 37 a 38 y 298 a 301, respectivamente.

d)   Dominios de unión a LexA y a otras proteínas. Los residuos activos para la unión de RecA al represor LexA y a otras proteínas como UmuD y represores fágicos, son los aminoácidos 229 y 243. El aminoácido 243 es un sitio de unión por el cual compiten el DNA y la proteína LexA. Adicionalmente, también se encuentra involucrada en la unión a LexA la región correspondiente al “bucle 1”.

La proteína RecA interviene en funciones celulares muy importantes, como la recombinación homóloga, la regulación de la expresión de los genes del sistema SOS y la mutagénesis SOS, lo que provoca un tipo de reparación del DNA altamente mutagénico. Debido a su importante función celular, su nivel basal es elevado (entre 1000 y 10000 monómeros por célula), y puede aumentar entre 20 y 50 veces en estado inducido.

¿CÓMO FUNCIONA?

La proteína LexA reprime un conjunto de genes cuyos productos están implicados en una serie de diferentes procesos celulares, tales como:

• La inhibición de la división celular
• Replicación error-prone (replicación errónea)
• Reparación de la escisión.

El control mediante la proteína LexA se ejerce mediante la unión específica de su dominio N-terminal a motivos palindrómicos largos de 16 pb en la región promotora de los genes SOS. Estos motivos, con la secuencia de consenso CTGTATATATATACAG (llamados cajas SOS) están típicamente situados cerca o dentro del sitio de unión a ARN polimerasa. Por lo tanto, la unión de un dímero LexA a la caja SOS interfiere físicamente con la actividad ARN-polimerasa, bloqueando eficazmente la iniciación de la transcripción y reprimiendo la expresión génica.

Por otra parte, la proteína RecA actúa como sensor del sistema SOS; la detección está mediada por la unión no específica de RecA a fragmentos de ADN de cadena sencilla, generados ya sea por interrupción de replicación controlada por ADN o por procesamiento enzimático de extremos rotos de ADN. Después de la unión, RecA adquiere un estado activo que le permite promover la escisión autocatalítica de LexA y varios otros represores transcripcionales. La escisión autocatalítica del enlace LexA inhibe eficazmente LexA de unirse a cajas SOS, induciendo de este modo la respuesta SOS.

La desrepresión de los genes SOS induce la expresión programada de una serie de genes destinados a tratar el daño del ADN y sus repercusiones dentro de la célula.

A medida que la detención de la horquilla de replicación es el principal desencadenante de la inducción de SOS, varios genes SOS, como recA son rápidamente inducidos a proteger y estabilizar el tenedor, mientras que un segundo conjunto de genes se expresa para tratar las lesiones ofensivas a través de la escisión de nucleótidos o mecanismos de reparación de recombinación.

El posible papel de DinI en la red reguladora de SOS.

La respuesta SOS es señalada por RecA vinculante a ssDNA que se acumula en la célula como resultado del daño del ADN. La inducción de la respuesta SOS conduce a la sobreexpresión de al menos 31 productos génicos. Entre ellos están RecA, LexA, y DinI, las proteínas implicadas en la autorregulación de SOS. El papel de DinI consiste en rechazar la respuesta SOS mediante la supresión de la señal SOS. DinI puede eliminar esta señal de dos maneras: evitando la interacción entre RecA y ssDNA o interrumpiendo ssDNA-RecA cofilaments.